哮喘的免疫诊断和检测技术
2007/06/26
李靖
广州呼吸疾病研究所变态反应科 510120
哮喘是气道反复接触了各种变应原而产生的慢性气道炎症的变态反应性疾病，免疫诊断和检测技术包括变应原的检测、气道炎症的确定以及炎症细胞和炎性介质的测定。
一、变应原检测
变态反应性疾病由变应原所引发，因此确定致病的变应原对防治此病有着十分重要的作用。对于吸入性过敏原，如尘螨、猫皮屑、犬皮屑、树花粉、草花粉、真菌和少数其他途径进入的药物（如青霉素等），主要籍助于皮肤试验（简称皮试）和血清中特异性IgE(sIgE)检测，两法通常相辅相成互为益彰。
(一)、皮肤试验问世于1909年。具有简单、快速、低花费和高敏感性的特点，因而至今仍可作为变态反应疾病变应原诊断不可缺少的重要手段。皮肤试验主要分为皮内试验和点刺试验两种
（1）皮内试验
皮内试验是目前应用最广、结果较可靠、测试剂量控制较严格的一种试验方法，也是皮肤试验的经典方法。近年来，由于此法较繁琐，有一定痛感，不适合于小儿患者，已逐渐被点刺试验所取代。
皮内试验是目前应用最广、结果较可靠、测试剂量控制较严格的一种试验方法，也是皮肤试验的经典方法。近年来，由于此法较繁琐，有一定痛感，不适合于小儿患者，已逐渐被点刺试验所取代。
（2）点刺试验
点刺试验是将抗原导入皮肤更浅表水平的一种简便的皮肤试验。试验时先在受试者前臂曲侧经消毒的皮肤上,滴一滴变应原浸液,然后用消毒的点刺针在滴有抗原的皮肤中央进行点刺。点刺针是定型设计的,该针长3cm左右,端部针尖长1mm,以柄肩限制针刺皮肤的深度。用该针在皮肤上垂直压破表皮,1秒后将针提起,2～3分钟后将皮试液擦去。15分钟左右观察结果。试验时应同时作阴阳性对照。点刺试验根据丘疹大小按以下两种方法判定结果：
丘疹平均直径：丘疹平均直径<3mm者为 (-), ≥3mm为 (+), ≥5mm为(++), ≥10mm为(+++), ≥15mm为(++++)。
组胺当量级别：以变应原及组胺所致丘疹面积比而定其反应级别。无反应或与阴性对照相同者为(-), 比值为组胺丘疹25～50%时为(+), 50～100%时为(++), 100～200%时为(+++), 200%以上时为(++++)。以(++), 或以上判定阳性。也有以比值为组胺丘疹50-100% 时为(+), 100～200%时为(++), 200%以上时为(+++), 出现伪足时为(++++)。以(+), 或以上判定阳性。
以往国内作点刺试验时无组胺阳性对照,其反应结果即以丘疹的平均直径表示,这忽略了个体的敏感性差异以及服药后的抑制因素。因此测定结果误差较大。设组胺阳性对照,避免了上述问题,提高了诊断的正确性。
国际上近年来对变应原皮试强调用组胺作阳性对照,用于点刺试验则称为组胺当量点刺,用以计算相对的反应强度,国内现已开始普及。由于组胺是一种生物活性物质,点刺在皮肤上后,数分钟内即可充血,出现丘疹反应,周围可产生红晕。通常于2分钟左右反应达到高峰,持续10分钟,故点刺后先于10分钟观察组胺对照结果,再于20分钟观察变应原反应结果,这样的判断较为可靠。
运用点刺试验,受试者几乎没有疼痛,小儿患者也能接受,且快速、简便,适合于一次进行多个变应原的测定。它所采用的变应原制剂可甘油化,稳定期长。由于点刺针针尖有一柄肩加以限制,如操作正确,皮肤不会出血,而且深度一致,易于自身或异体对照。除了以上优点外,还具有不会出现非特异性的皮肤反应、特异性高、重复性和对比性好等优点,并且,点刺试验几乎不会出现全身反应。由于点刺试验不向皮内用力推入皮试液,避免了对皮肤的刺激,所以假阳性结果很少,与其他检测特异性变应原的试验符合率较高,因此,有替代皮内试验法的趋势。但由于点刺试验敏感性较皮内试验差,因而所需用的变应原浓度比皮内试验高出100倍。皮试有时可出现假阳性和假阴性反应。
假阳性反应的原因有：
① 变应原浓度太高；
假阳性反应的原因有：
① 变应原浓度太高；
② 变应原本身含有大量组胺或促组胺释放的物质；
③ 溶剂的非特异刺激,如pH和渗透压有偏差,或甘油浓度过高；
④ 患者皮肤敏感性过高,如划痕症阳性者；
假阴性的原因有：
① 受试者年龄过大或过小；
③ 溶剂的非特异刺激,如pH和渗透压有偏差,或甘油浓度过高；
④ 患者皮肤敏感性过高,如划痕症阳性者；
假阴性的原因有：
① 受试者年龄过大或过小；
② 皮试变应原效价降低或注入变应原剂量太少；
③ 药物因素的影响,如皮试前应用抗组胺类药物；
④ 近期刚发生过强过敏反应,患者体内的过敏性抗体处于暂时"耗竭"状态。
③ 药物因素的影响,如皮试前应用抗组胺类药物；
④ 近期刚发生过强过敏反应,患者体内的过敏性抗体处于暂时"耗竭"状态。
国外目前推广将各种已包被了不同变应原并密闭包装的点刺器具,使用时只要打开包装，无需再滴加变应原,并备有阴阳性对照。这种试验被称之为“干点刺试验”。该试验操作极为方便,且由于变应原处于干燥状态而不易被降解，故有效期长。
近年来强调变应原的标准化，即皮试液组分和各组分间的比例恒定。随着分子克隆技术的发展，已有重组变应原问世，使皮试质量更加完善。
对大多数吸入性变应原,皮试阳性,又有临床过敏的病史,则提示皮试变应原为该变应性疾病的致敏原。相反,皮试阴性,临床阴性病史者,可能不属于变应性疾病。
（二）、血清IgE检测
(1) 血清总IgE（Serum total IgE）
IgE是介导I型变态反应的抗体，血清总IgE升高，提示有患变态反应疾病的可能。测定的方法很多，国内多用酶标法，也可采用放免法或荧光酶标法。总IgE的测定应有严格之质控，除了一般的阳性质控外，尚应有不同范围的质控值。在每次测定时都要做低水平的、中度水平的和高水平的血清质控。影响总IgE水平的因素：
①年龄：过去认为总IgE不能通过胎盘，故认为脐血中无IgE，近年来由于检测技术的进步，有人报告在某些患有变态反应病的产妇的胎儿的脐血中有微量的IgE检出，新生儿总IgE水平是非常低的，随着年龄的增长总IgE的水平随之增高，学龄前儿童总IgE可接近成人水平，青春期水平最高，30岁后逐渐下降，老年人总IgE水平处于较低水平。
②性别：男性总IgE水平高于女性，其机制尚不清楚，有人认为可能与男性吸烟者较多有关。
③种族：不同种族血清总IgE的水平有很大差别，这可能是受遗传的影响，混血人种的总IgE比白人高3～4倍，黑人水平更高，黄种人水平也较高。
④寄生虫感染可使总IgE水平明显升高，在我国，特别是在农村，寄生虫感染率较高，因而总IgE的水平也偏高。
①年龄：过去认为总IgE不能通过胎盘，故认为脐血中无IgE，近年来由于检测技术的进步，有人报告在某些患有变态反应病的产妇的胎儿的脐血中有微量的IgE检出，新生儿总IgE水平是非常低的，随着年龄的增长总IgE的水平随之增高，学龄前儿童总IgE可接近成人水平，青春期水平最高，30岁后逐渐下降，老年人总IgE水平处于较低水平。
②性别：男性总IgE水平高于女性，其机制尚不清楚，有人认为可能与男性吸烟者较多有关。
③种族：不同种族血清总IgE的水平有很大差别，这可能是受遗传的影响，混血人种的总IgE比白人高3～4倍，黑人水平更高，黄种人水平也较高。
④寄生虫感染可使总IgE水平明显升高，在我国，特别是在农村，寄生虫感染率较高，因而总IgE的水平也偏高。
IgE是一种不正常的抗体，一般不应称“正常值”，可称为高限的端值，由于总IgE在正常人中呈现偏态分布，一般需将样本值经对数转换后才近似正态分布。总IgE增高在多数情况下反映患者属过敏体质，如特应性（atopic）的患者总IgE均增高。当然在某些寄生虫感染的情况下，总IgE也可升高。总IgE不具有特异性过敏原诊断的价值。
（2）血清特异性IgE （Serum specific IgE）
特异性IgE (sIgE) 的测定在变态反应性疾病体外诊断中占有重要地位,现已被广泛使用。由于血中IgE含量甚微，仅为血中IgG的十几万分之一，特异性IgE含量则更微,因此采用一般的免疫学方法并不能检测到特异性IgE，需采用由标记上同位素或酶的抗人IgE抗体（作为二抗）以及固相化的各种变应原所建立标记免疫分析技术进行测定。若待测血清中有针对变应原的sIgE,即可与固相化的变应原形成变应原- sIgE复合物,再加入标记的抗人IgE抗体,最终形成了"固相化的变应原-sIgE-标记的抗人IgE抗体的复合物, 若标记物为同位素,则应用γ-计数仪测定结合的同位素活性；若标记物为酶,则通过酶催化底物产生的颜色,或发光（包括荧光）,再经特定仪器十分灵敏进行检测。
sIgE检测的优点是：
① 不受对症治疗用药的影响,也不受过敏症状的干扰；
② 适用于皮试呈现假阳性的划痕症患者、严重皮炎不能作皮试者以及皮肤反应差的老年人及3岁以下儿童；
③ 没有用昆虫、动物皮屑等变应原作皮试时产生的全身不适感。
缺点是：
① 费用较昂贵,需一定设备、费时、一般需1天时间才能得出结果；
② 血清中存在的非IgE抗体,如脱敏治疗过程中所产生的IgG类阻断抗体也可与变应原结合,干扰了IgE抗体与变应原的结合；
③ 不是所有的变应原都适用,如药物和细菌等并不适用；
④ 方法种类繁多，有酶免法、荧光酶免法、化学发光法等；所采用的固相化变应原的固相载体有96孔塑料板、圆形纸片、微孔薄膜、内含多孔弹性纤维素粒的帽状新型载体和蛋白芯片等；所用的结合抗人IgE抗体（作为二抗）的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、b－半乳糖苷酶和尿素酶等；应用的抗人IgE来源也不同，有单克隆抗体、多克隆抗体（包括从马、羊、兔来源）。由于以上差异，以及抗人IgE抗体的亲和力和效价不尽一致，各厂家又备有自己的标准品，因此所得的结果差异可很大，可比性尚不够满意。不同公司的商品试剂盒所得结果相互间很难作比较。
目前公认荧光酶免法（ImmunoCAP；Pharmacia Diagnostics；Uppsalo,Sweden）是检测sIgE的金标准。该法所采用的固相化变应原是一个很小的塑料帽状物即CAP，其内置有多孔性、弹性和亲水性的纤维素粒。由于此粒多孔，增加了与变应原接触的表面积，可吸附更多的变应原，是普通载体的数倍或数十倍。由于化学反应是在孔内进行的，故抗原抗体的反应距离缩短，反应可迅速达到平衡，缩短了试验时间，又因纤维素粒具有弹性，故可使用自动冲洗仪进行自动化挤压式冲洗，将未被结合的物质洗掉。在酶标二抗方面以单克隆抗体替代多克隆抗体。在显示方法上使用的标记物是b-半乳糖甙酶，其底物称 4-甲基伞桂-β-D半乳糖苷。此酶作用于4-甲基伞桂β半乳糖甙，使之产生荧光，通过荧光分光光度计测出荧光强度。荧光强度与特异性IgE抗体呈线性关系。以上仪器、试剂与计算机软件合称CAP-System。此法同样受血清中特异性IgG的干扰降低其敏感性。近年又有新方法问世，即将抗人IgE抗体固相化，可特异的与待测标本中IgE相结合，防止了IgG的干扰。对于摄入性过敏原，皮试结果远不及吸入性过敏原可靠，食物过敏的病史与皮试结果的符合率较低，sIgE敏感度约在40～50% 左右，这可能因食物品种的复杂性以及食物抗原经消化酶作用，加之烹饪等使食物抗原性与食物皮试抗原可能不一致有关。此外，有些食物过敏并非由IgE所致，若仅检测sIgE并不会得出阳性结果。
sIgE检测的优点是：
① 不受对症治疗用药的影响,也不受过敏症状的干扰；
② 适用于皮试呈现假阳性的划痕症患者、严重皮炎不能作皮试者以及皮肤反应差的老年人及3岁以下儿童；
③ 没有用昆虫、动物皮屑等变应原作皮试时产生的全身不适感。
缺点是：
① 费用较昂贵,需一定设备、费时、一般需1天时间才能得出结果；
② 血清中存在的非IgE抗体,如脱敏治疗过程中所产生的IgG类阻断抗体也可与变应原结合,干扰了IgE抗体与变应原的结合；
③ 不是所有的变应原都适用,如药物和细菌等并不适用；
④ 方法种类繁多，有酶免法、荧光酶免法、化学发光法等；所采用的固相化变应原的固相载体有96孔塑料板、圆形纸片、微孔薄膜、内含多孔弹性纤维素粒的帽状新型载体和蛋白芯片等；所用的结合抗人IgE抗体（作为二抗）的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、b－半乳糖苷酶和尿素酶等；应用的抗人IgE来源也不同，有单克隆抗体、多克隆抗体（包括从马、羊、兔来源）。由于以上差异，以及抗人IgE抗体的亲和力和效价不尽一致，各厂家又备有自己的标准品，因此所得的结果差异可很大，可比性尚不够满意。不同公司的商品试剂盒所得结果相互间很难作比较。
目前公认荧光酶免法（ImmunoCAP；Pharmacia Diagnostics；Uppsalo,Sweden）是检测sIgE的金标准。该法所采用的固相化变应原是一个很小的塑料帽状物即CAP，其内置有多孔性、弹性和亲水性的纤维素粒。由于此粒多孔，增加了与变应原接触的表面积，可吸附更多的变应原，是普通载体的数倍或数十倍。由于化学反应是在孔内进行的，故抗原抗体的反应距离缩短，反应可迅速达到平衡，缩短了试验时间，又因纤维素粒具有弹性，故可使用自动冲洗仪进行自动化挤压式冲洗，将未被结合的物质洗掉。在酶标二抗方面以单克隆抗体替代多克隆抗体。在显示方法上使用的标记物是b-半乳糖甙酶，其底物称 4-甲基伞桂-β-D半乳糖苷。此酶作用于4-甲基伞桂β半乳糖甙，使之产生荧光，通过荧光分光光度计测出荧光强度。荧光强度与特异性IgE抗体呈线性关系。以上仪器、试剂与计算机软件合称CAP-System。此法同样受血清中特异性IgG的干扰降低其敏感性。近年又有新方法问世，即将抗人IgE抗体固相化，可特异的与待测标本中IgE相结合，防止了IgG的干扰。对于摄入性过敏原，皮试结果远不及吸入性过敏原可靠，食物过敏的病史与皮试结果的符合率较低，sIgE敏感度约在40～50% 左右，这可能因食物品种的复杂性以及食物抗原经消化酶作用，加之烹饪等使食物抗原性与食物皮试抗原可能不一致有关。此外，有些食物过敏并非由IgE所致，若仅检测sIgE并不会得出阳性结果。
（三）、血清IgG检测
IgG抗体反应水平的检测是体液免疫的一项有用的指标、尤其是在评价特异性免疫治疗的疗效时。在健康人中，IgG约占总血清免疫球蛋白的75％，根据其重链抗原识别区而分为4个亚群（IgG1到IgG4），在血液中各亚群的组成为：IgG1占60～70％、IgG2占14～20％、IgG3占4～8％而IgG4占2～6％。变应原特异性IgG可阻断由IgE介导的嗜碱性粒细胞的组胺释放。但在自然状态下，人体接触少量的致敏原后引起IgG的变化很小（ng/ml）或不可测出，而在接受注射抗原如进行特异性免疫治疗后血清IgG则有显著的增高（mg/ml）。检测变应原特异性IgG有酶联免疫法（ELISA）和固相放射免疫法（SPRIA）。IgG4在慢性抗原刺激如免疫治疗后的改变尤为显著，测定血清IgG4的变化水平可用于评价特异性免疫治疗的疗效和观察患者有无长期接触某种致敏原。目前多种免疫检测的方法测定变应原特异性IgG4。如SPRIA法是以吸附在微孔板或纤维素珠的固相抗原与血清的特异性抗体结合。IgG4的抗原抗体符合物再与抗人的IgG4放射标记或酶标记物结合，然后以特定的读记仪器进行测定。
另外，还可以用捕捉血清IgG4的固相特异性抗体与患者血清进行反应，再以特异性放射标记抗原与IgG4抗体复合物结合后进行测定。这种方法可避免IgG其他亚群的干扰，然而，当所测定的变应原特异性IgG4的量很少时，这种干扰仍会发生。
另外，还可以用捕捉血清IgG4的固相特异性抗体与患者血清进行反应，再以特异性放射标记抗原与IgG4抗体复合物结合后进行测定。这种方法可避免IgG其他亚群的干扰，然而，当所测定的变应原特异性IgG4的量很少时，这种干扰仍会发生。
（四）、 激发试验
激发试验是指人为得将一些变应原与靶器官（如鼻、支气管、消化道）相接触，继而通过靶器官功能的改变或所诱发产生的临床症状诊断变应原，并可了解器官的反应性。因为它在人体上进行，所以也属于体内试验。可按测试液进入途径分为眼结膜激发试验、鼻粘膜激发试验、支气管激发试验和口服食物激发试验。
变应原气管内激发试验（bronchial challenge testing, BCT）是采用抗原气雾吸入激发，或用抗原浸液气管内滴入激发。BCT是通过让患者雾化吸入变应原后观察患者有无哮喘发作及肺通气功能的变化，从而确认引起哮喘发作的变应原，以及机体对该变应原的敏感程度。这在职业性哮喘的诊断中尤其重要。
试验应在哮喘缓解期进行，试验前2～3天内停用任何有关哮喘治疗的药物，包括β-受体激动剂、糖皮质激素、茶碱、肥大细胞膜稳定剂等。试验开始时首先测定患者的基础肺功能（FEV1或PEFR等）。进行BCT的基本条件与非特异性支气管激发试验一致，应≥70%预计值。常用的吸入变应原为各种花粉、真菌、螨、室内尘土等。一般以10倍的梯度配制溶液系列，将变应原稀释成浓度为1:100、1:1 000、1:10000、1:100000等。如估计在直接吸入下一浓度有可能诱发哮喘发作，则可在上述浓度系列中插入中间浓度的稀释液，如1:500、1:5000等。吸入时的变应原浓度不宜过高，其最高吸入浓度依变应原而不同，一般室内尘土示超过1:10，花粉不超过1:100，真菌不超过1:1000。
在进行变应原支气管激发试验过程中应注意观察患者的反应并在10分钟后复查患者肺功能指标。当患者出现：①胸憋、胸闷、喘息；②肺部闻及哮鸣音；③FEV1下降大于15%时，表明该试验结果阳性，应立即终止试验。若吸入最高浓度的抗原稀释后仍无上述表现，则可判为阴性。
在试验过程中应注意：①为辟免支气管哮喘的严重发作，因此抗原稀释液必须从最低浓度开始，视反应逐渐提高浓度；②一般应观察24h以上，即同时观察速发相反应和迟发相反应；③在进行多种变应原的BCT时，两次激发试验间隔时间应足够，以免影响结果。
（五）、从嗜碱性粒细胞水平检测变应原
嗜碱粒细胞在外周血中虽然含量甚微，但它表面存有高亲和力IgE受体可吸附IgE，当与所加入的变应原作用后，会脱颗粒和释放的组胺,，因此可根据它被激活后胞浆内颗粒脱出不被染色的特点,，测定了所释放组胺量，以及通过检测嗜碱粒细胞激活时表面所表达的CD36以诊断变应原。
二、气道炎症的测定
哮喘是慢性气道非特异性炎症,气道炎症是造成支气管上皮损伤、气道重塑和气道阻塞的主要因素。研究哮喘气道炎症的主要方法有支气管镜活检、支气管冲洗（bronchial washing, BW）、支气管肺泡灌洗（BALF）及痰检查。
（一）、诱导痰的细胞学和炎症介质检测
自发痰的检查也可用于研究气道炎症，但一些缓解期的哮喘患者自发痰量少不能满足检查需要，急性发作期的哮喘患者则可由于通气过度使气道水分蒸发较多，痰液粘稠不易咳出，而且自发痰受唾液的影响较大，其生化检查不易标准化。通过吸入雾化高渗盐水诱导痰液生成来研究哮喘气道炎症，因其安全、简易、无创等特点及良好的重复性、可靠性，因而越来越受到人们的关注。文献报道诱导痰的成功率为60～85%。普通认为超声雾化起的成功率高于喷射式雾化器，因为后者产雾量少。
（1）痰液诱导及处理的方法
痰液诱导的具体步骤：测FEV1→吸入沙丁胺醇200ug→20分钟后再测FEV1，大于60%预计值则继续操作→用Fisoneb超声雾化吸入3%盐水7ml→再测FEV1，若FEV1下降超过20%或出现严重的难以忍受的症状则停止诱导；或FEV1下降10%~20%，则再次吸入沙丁胺醇200 ug；若FEV1下降不超过10%则继续操作→擤鼻涕、漱口、吞水→排痰→用4%~5%的盐水重复以上步骤。
（2）痰标本处理
痰液的处理应尽早进行，有两种方法：一种为减少唾液污染，选择其中粘稠部分或通过倒置显微镜选择无鳞状上皮细胞的部分（所谓“选择痰”）进行处理；另一种是对患者所排出的可能包含部分唾液的全部痰液（所谓“整个痰”）进行处理。痰处理的操作步骤如下：选择痰→痰液称重→用4倍体积0.1%DDT孵育→用巴斯特吸管涡状抽吸15秒→在摇床上摇15分钟→用于DDT等体积的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（D-PBS）混匀→摇5分钟→用48mm尼龙沙布过滤→790g离心10分钟→留取上清液以备检测液相成分→将沉淀细胞再次悬浮于D-PBS中→在Neubauer的细胞仪中测细胞总数→用台盼蓝（Trypan blue）染色检测细胞活力→调整细胞悬浮密度至1´106个细胞/ml,将75ul细胞悬浮液置于细胞离心机中450r/min离心6分钟→①风干，瑞氏染色，细胞分类计数；②用Carnoy’s细胞固定液固定，吐鲁丁蓝（Toluidine blue）染色，异染细胞计数。
（3）痰细胞学检测的意义
哮喘患者痰中嗜酸粒细胞增多可能是激素治疗效果满意的预示，在临床工作中有应用价值。Pizzichini等对44例痰中无嗜酸粒细胞增多的长期咳嗽患者（除外变应性，肺功能及气道反应性正常）每天用布地奈德800ug治疗2周，无效；而对8例痰中嗜酸粒细胞明显增多的吸烟引起气管炎患者同样施以激素治疗，患者咳嗽明显减轻，肺功能改善，痰中嗜酸粒细胞减少。通过观察药物治疗前后诱导痰中细胞组分及炎症介质及分子生物学、免疫学改变，可以帮助我们研究药物的作用机制。有报道，茶碱和罗红霉素治疗后，哮喘患者诱导痰中嗜酸粒细胞计数下降，ECP水平降低，证明二者均有抑制嗜酸粒细胞性气道炎症的作用。对于病情未控制的哮喘患者，长期应用沙丁胺醇可以改善肺功能和临床症状，但对痰中增多的嗜酸粒细胞计数并无影响，而吸入糖皮质激素既能改临床改症状又能抑制气道炎症。有报道，使用糖皮质激素后诱导痰中嗜酸粒细胞的减少与PEF的改善相一致，FEV1的改善与痰中嗜酸粒细胞及IL-5的下降相平行。糖皮质激素治疗后症状、FEV1、血嗜酸粒细胞及ECP水平改善较快，而痰中相应指标的改善相对延迟。可以看出，作为气道炎症性疾病的哮喘的治疗，不能单凭临床症状及肺功能决定药物的增减及应用时间，应以气道炎症是否改善为依据。
（二）呼出气一氧化氮分析
近年来随着对一氧化氮（nitric oxibe, NO）病理生理作用研究的深入，人们逐步认识到NO在哮喘气道炎症中的作用，而且随气道炎症的变化而变化，气道炎症细胞、气道上皮细胞、血管内皮细胞等均可以产生NO。由于呼出气NO水平反映气道炎症的重要指标，且在不同疾病发生相应变化。呼出气NO测定方法大致分为带机测定（online measurement）和脱机测定(offline measurement)两种，带机测定是在被测者呼气时就能显示结果。在呼气时气体被分析仪取样，患者坐在分析仪旁边平静呼吸产生连续的气流防止口腔压增高，流量和压力通过生物反馈信号调节，记录呼气未NO浓度平台值，然后选择测出平均值。而脱机测定则为把被测者呼出气收集到一个合适的容器里，然后再进行测定，被测者可以在家中或在学校取样本，然后送到实验室进行测定。标本要求在24小时内测定。呼出气NO浓度（fractional exhaled NO concentration, FENO）通常用ppb(parts perbillion)表示，等于nl/l(nanoliters per liter)。单位时间NO排出量（VNO），是通过NO排出量乘以每分钟呼气流速而得出。鼻NO以nasal FENO表示。过去许多文献用不同名词表示VNO，如NO release,NO excretion,NO secretion 和NO production等，容易混淆。
虽然呼出气NO浓度增高对哮喘的诊断无特异性，但对于鉴别慢性咳嗽是哮喘还是其他原因可能有帮助。Dupont等测定健康人和确诊哮喘患者呼出气NO浓度，得出当呼出气NO浓度>15nl/L时，诊断哮喘的特异性为90%，阳性预测值为95%。呼出气NO浓度可以用来鉴别是否变奕性哮喘，因为非变应性哮喘患者呼出气NO浓度正常。在轻症哮喘，呼出气NO浓度与皮肤划痕试验、总IgE、血嗜酸粒细胞明显相关。呼出气NO浓度的定期测定可能有预测哮喘发生可能性的价值，特别是对亚临床类型的哮喘患者，这些患者肺功能正常，支气管扩张试验阴性。
要知道不同抗炎药治疗哮喘的反应是比较困难的，目前还没有一项试验可用来对气道炎症进行定量分析。血检查不可能完全反映气道的情况，诱导痰嗜酸粒细胞来源于较大气道而不是小气道。呼出气NO浓度测定可用来监测抗炎药对哮喘的疗效，及其与哮喘急性发作缓解的关系。
三、炎症细胞和炎性介质的测定
参与哮喘的炎症细胞包括抗原呈递细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性和嗜碱性粒细胞等，而参与哮喘的炎性介质有组胺、白三烯、细胞因子等。检测炎症细胞和炎性介质大多用于科研，这里介绍临床较常进行的两项。
(一)、嗜酸粒细胞及其毒性蛋白的测定
外周血中嗜酸粒细胞(EOS)分类计数或直接计数，EOS增高是过敏性炎症的特征，但某些寄生虫病、传染病和血液病时EOS也会增高。而局部体液(鼻分泌物、皮疱液、支气管肺泡液等)中的EOS增高可作为变应性疾病诊断的直接依据。近年来开展诱导痰中EOS检测，即通过超声雾化吸入一定量的高渗盐水（通常为3～5％氯化钠液）诱导下呼吸道产生分泌物,然后经涂片、染色及显微镜下进行EOS计数,算出其百分率。当百分率大于3％时有诊断价值。此外，由于每个EOS胞浆中含有200个以上颗粒，当EOS被激活后会释放带有阳离子电荷的4种细胞毒性蛋白，包括嗜酸粒细胞阳离子蛋白(eosinophil cathionic protein，ECP)、嗜酸粒细胞过氧化物酶(eosinophil peroxidase，EPO)、主要碱性蛋白(main basic protein，MBP)、嗜酸粒细胞蛋白X／嗜酸粒细胞衍生的神经毒素(eosinophil protein X/eosinophil derived neurotoxin，EPX/EDN)，其中应用较多的是ECP。血清和痰液中ECP的测定对呼吸道过敏，特别是过敏性哮喘的诊断有重要意义。但在消化道过敏和特应性皮炎，ECP测定的意义远较呼吸道过敏逊色，有人认为仅30％消化道过敏者血清中ECP会增高。
此外，ECP测定的影响因素也较多，诸如采血的试管、分离血清所需的凝血时间、凝血时的温度、离心分离血清的离心力、离心时间等，因此需对这些条件作以下严格规定：采血应使用玻璃管或SST管,不可使用塑料管；应尽可能在20～250C的室温条件下使血液凝集,温度升高可导致ECP值升高；采用玻璃管时,血凝时间严格控制在60土10分钟之内。当采用SST管时, 血凝时间在60～120分钟均可；应固定离心的离心力（g）充分离心分离血清,以避免ECP值的假性升高。
此外，ECP测定的影响因素也较多，诸如采血的试管、分离血清所需的凝血时间、凝血时的温度、离心分离血清的离心力、离心时间等，因此需对这些条件作以下严格规定：采血应使用玻璃管或SST管,不可使用塑料管；应尽可能在20～250C的室温条件下使血液凝集,温度升高可导致ECP值升高；采用玻璃管时,血凝时间严格控制在60土10分钟之内。当采用SST管时, 血凝时间在60～120分钟均可；应固定离心的离心力（g）充分离心分离血清,以避免ECP值的假性升高。
（二）、类胰蛋白酶（ tryptase）的测定
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