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Toll样受体在哮喘及其他过敏性疾病中的作用

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发表于 2011-12-22 11:21 |显示全部楼层
 

Toll样受体在哮喘及其他过敏性疾病中的作用

祁聪聪  刘春涛

成都,四川大学华西医院 610041

 

Toll样受体(TLRs)是细胞表面受体家族,是机体抗感染免疫的第一道防线,在触发天然免疫和获得性免疫中起重要作用,TLRs可能与多种疾病的病理生理相关,现有研究表明,在哮喘以及其他过敏性疾病的发生和发展中,TLRs也可能扮演者重要的角色。

1、TLRs家族

TLRs是一组具有相似结构和功能的模式识别受体,它们均属I型跨膜蛋白,由胞外区(550-980个氨基酸)、跨膜段和胞内区(约130个氨基酸)3部分组成,胞外区富含亮氨酸重复序列,能识别病原体成分,胞内区有一个Toll/IL-1R(TIR)区域,是高度保守的蛋白质相互作用区,通过与转接分子的相互作用转导信号。目前发现哺乳动物TLRs家族有15个成员,其中人类有10种,小鼠13种。根据氨基酸序列和基因组结构,TLR1、TLR2、TLR6和TLR10构成TLR2亚家族,TLR7、TLR8和TLR9构成TLR9亚家族。

TLRs表达于单核细胞、巨噬细胞、DC(树突状细胞)和粒细胞等免疫细胞,也表达于气道上皮细胞和皮肤这些宿主和病原体相互作用的部位。其中TLR1、2、4、5、6、10表达于细胞表面,主要针对细菌产物。TLR2与TLR1、TLR6相互作用识别革兰氏阳性菌的肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、磷壁酸、脂蛋白等。TLR4是有效识别革兰阴性菌LPS(脂多糖)的关键受体,也可识别病毒蛋白。而TLR3、7、8、9主要表达于细胞内,识别病毒的核酸成分,TLR9识别非甲基化的CpG基序,在细菌和某些病毒的DNA识别中起作用。哺乳动物的TLRs在直接激活宿主防御机制中发挥主导作用,激活的TLRs不仅刺激先天性免疫,产生直接抗微生物效应,而且还通过合成细胞因子而增强获得性免疫。

2、TLRs对过敏性疾病的调节作用

2.1 TLR2

TLR2是Treg(调节性T细胞)的重要模式识别受体,其基因定位于染色体4q31.3至q32上。TLR2具有几种独特的属性:(1)可以和多种外源性配体结合;(2)可以表达于多种不同类型的细胞;(3)可以和其他的TLR形成异二聚体,能够特异性地识别低浓度的配体。

关于TLR2和过敏性疾病的关系已经进行了大量的研究,但结果不尽相同。一项研究发现TLR2的配体诱导机体产生Thl反应。在尘螨致敏的小鼠过敏性鼻炎模型中,Pam3CSK4可以减少肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞和炎细胞总数,降低血清总IgE水平,增加肺泡灌洗液或脾细胞的IFN-γ浓度,显著降低IL-13水平,显示Pam3CSK4可以通过TLR2刺激APC(抗原递呈细胞)分泌某些细胞因子如IL-12和IFN-γ,促进T细胞合成IFN-γ,导致Th2分化受抑制,使Th2应答倾向于Th1应答。Velasco等也发现TLR2配体可以减轻过敏性炎症,Patel M等在哮喘动物模型过敏原激发前后,也发现了类似的现象。但也有研究得出不同的结果,有报道TLR2的激活剂牙龈卟啉菌LPS可能会诱导Th2反应。Redecke等发现在哮喘小鼠模型中,TLR2的配体Pam3Cys激活APC后可诱导Th2相关效应因子IL-13、IL-1β等的表达,在Th2介导的炎症中起到重要作用。

研究发现TLR2在调控Treg增殖和功能方面发挥关键作用。实验表明TLR2介导的信号可能是Treg增殖强有力的协同刺激信号,但同时可能会减弱Treg的抑制功能,TLR2缺陷小鼠体内Treg细胞数量明显减少,给予TLR2配体可使野生型小鼠体内Treg细胞增多,TLR2活化后可抑制Treg上Foxp3等免疫抑制表型的表达,同时能够上调Treg的IL-2受体表达,从而减弱Treg的免疫抑制功能。大量研究证实Treg可以抑制Th2细胞的增殖分化以及细胞因子的产生,推测TLR2减弱Treg的抑制功能可能会诱发Th2细胞介导的炎症。

TLR2亚家族基因变异可能影响哮喘易感性。TLR2/rs7656411 TT的变异能够影响TLR与DNA相互作用的效果,与那些具有野生型G-G纯合子的个体相比,具有TLR2/rs7656411 TT纯合子变异的个体患哮喘的风险显著降低。在德国和奥地利农村儿童中进行了有关TLR2基因多态性与变态反应的研究,研究表明,在携带有TLR2-16934T等位基因的农场儿童中,哮喘发病率及症状严重程度和花粉热发病率都有所降低,而针对137个日本哮喘家系的研究发现TLR2基因多态性与哮喘或IgE水平无关。

现有的研究结果虽然不完全一致,但表明在过敏性气道炎症中TLR2具有一定的作用,其表达量或活性变化均可能会影响过敏性疾病的发生和发展。研究表明,TLR2在LPS的作用下表达会逐渐增加,TLR2对LPS的识别需要与TLR4形成异二聚体,在TLR4激活后TLR2才能作为“第二受体”被启动表达。

2.2 TLR4

无论是否是特应质个体,成人和儿童的鼻粘膜均可表达TLR4。长期经受病原微生物攻击的鼻粘膜上皮通过自身表达TLR2和TLR4,识别病原体的PAMPs(模式识别受体)并与之结合,同时激活胞内信号转导途径,启动天然免疫。

多数TLRs的信号传递需要通过MyD88(myeloid differentiation protein,接头蛋白髓样分化蛋白)信号通路(TLR3除外),TLR4则通过MyD88和TIRAP(TIR domain containing adapter protein,含Toll/IL-1受体结构域的转接蛋白)两个信号通路调控相应胞因子的合成。MyD88依赖通路可能主要调控TLR4介导的炎性细胞因子的产生;而MyD88非依赖(即TIRAP依赖)通路可能主要调控TLR4介导的DC的成熟和获得性免疫正向调节分子如MHC、共刺激分子CD80和CD86等的表达。对TLR4信号途径的研究表明,高浓度和低浓度LPS作用于TLR4导致Th细胞向不同的方向分化。相对高浓度LPS(LPS>10ng/ml)刺激的TLR4可抑制小鼠哮喘模型的过敏性炎症,这可能与TLR4刺激Treg扩增并增强其免疫抑制功能有关。相反,用低浓度的LPS滴鼻刺激小鼠哮喘模型,小鼠BALF(支气管肺泡灌洗液)嗜酸性粒细胞增多,血浆中Th2细胞因子表达升高,提示此种刺激促使免疫系统向Th2反应偏移。低浓度LPS诱导的Th2优势分化也是是由TLR4介导的,并与DC的活化有关。

研究显示过敏性疾病与TLR2、4、9的关系更密切。有实验观察到过敏性鼻炎大鼠模型受到TLR4配体LPS刺激后可引起鼻炎症状的加重,提示TLR4可促进过敏性鼻炎的发病。而在对TLR4基因缺失小鼠(C3H/HeJ)的研究中发现,TLR4缺失可以导致哮喘造模的失败,表现为OVA(卵白蛋白)腹腔注射及鼻内给药不能引起小鼠出现哮喘症状及血浆特异性IgE水平的升高。尘螨是中国哮喘/过敏性鼻炎病人最常见的致敏原,在李鸿佳等的研究中,OVA哮喘模型组与对照(生理盐水)组小鼠气道上皮的TLR4表达的差异无统计学意义,而屋尘螨哮喘模型组小鼠气道上皮的TLR4表达与OVA组相比明显增强,提示TLR4是屋尘螨的主要模式识别受体,推测屋尘螨在体内可诱导气道上皮TLR4表达上调,通过MyD88介导的胞内信号转导途径,释放TNF-a、IL-6等炎症因子,参与哮喘发病。

研究发现,培养的ASMC(气道平滑肌细胞)可自发表达TLR4蛋白质及mRNA,TNF-a、IL-1β及IFN-γ等能显著上调ASMC上TLR4的表达,而LPS通过TLR4刺激ASMC能增加IL-6、IL-8等的表达。LPS处理后小鼠ASMC能增强对缓激肽诱导的收缩反应,可见TLR4亦能够调节ASM收缩功能。目前还发现上皮细胞的TLR4可以识别结合尘螨抗原,激活DC及其下游信号通路,诱导气道炎症,因此推测吸入TLR4拮抗剂可能有利于治疗尘螨引起的哮喘。

正常情况下,Treg少量表达TLR4,而在感染或炎症状态下Treg高表达TLR4。已报道Treg的TLR4结合LPS后可以上调Treg的几种表面标志,并且在不需要TCR(T细胞受体)配体的基础上诱导Treg的扩增和存活。近来证实大多数TLRs的装配都依赖热休克蛋白gp96,转基因小鼠细胞表面gp96的异位表达可以引起TLR4的高应答。通过检测细胞内Foxp3蛋白表达,Jie Da等发现野生型和gp96转基因小鼠脾脏及胸腺Treg的数量和百分比没有差别,但转基因小鼠Treg的抑制功能要显著高于野生型小鼠,推测gp96转基因小鼠Treg功能的增强是Treg表面gp96长期诱导TLR4的结果,同时还发现TLR4缺陷的gp96转基因小鼠失去了抑制CD4+CD25?T细胞扩增的功能,从而证明gp96转基因小鼠Treg的抑制功能依赖于TLR4。

研究TLR的基因多态性与过敏性疾病关系对于明确疾病的遗传学基础及易感性具有重要意义。最先发现的TLR SNP(单核苷酸多态性)是TLR4-A896G和TLR4-C1196T。在瑞典儿童的研究中表明,LPS诱导的IL-12和IL-l0低应答和TLR4-Asp299Gly有关,LR4-Asp299Gly是哮喘发病风险增加的独立危险因素。在土耳其儿童中的研究结果与其一致,研究者发现TLR4-A896G和TLR4-C1196多态性与过敏性哮喘的严重度有关,并且TLR4的辅助分子CD14-C159T基因多态性与血清总IgE有关。但在日本人群中没发现TLR2、TLR3、TLR4、TLR9基因的SNP与哮喘的发病有关,Fonseca等的研究也未发现TLR4基因多态性与哮喘发病的相关性。

2.3 TLR9

TLR9广泛表达于体内各组织,在人类气道上皮、鼻窦组织细胞、肥大细胞和DC中均有表达,而pDCs(浆细胞样树突状细胞)则是介导TLR9依赖性应答的关键细胞。

现有研究表明免疫细胞(淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等)对CpG-ODN(非甲基化CpG二聚核苷的特定碱基序列)的识别和信号转导是通过TLR9实现的,免疫细胞通过胞内TLR9感受入侵病原体CpG基序,经信号转导通路,诱导TNF-β、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ等Thl型细胞因子的分泌,上调协同刺激分子的表达,促进B细胞增殖,激活巨噬细胞,促进DC成熟,诱导Thl型免疫应答,减轻Th2细胞介导的气道炎症。Liu等发现,B细胞CpG与TLR9结合可诱导非信号转导因子和转录激活因子1依赖性信号通路,促使T-bet的表达,从而诱导Thl优势分化,而T-bet可以抑制GATA-3的表达,后者又是Th2免疫应答的重要转录因子。TLR2、TLR4、TLR6基因缺陷的小鼠对CpG-ODN反应与正常无异,而TLR9缺陷的小鼠对CpG-ODN反应完全消失。CpG-ODN可诱导NF-kB等数种信号分子的激活,但在TLR9缺陷的小鼠严重受损,表明TLR9为病原DNA-CpG基序激活免疫细胞的过程所必需。

有少数研究表明TLR9多态性和过敏性疾病有关,但结果也不尽相同。Lazarus报告了67个欧裔美国哮喘病人TLR9启动子多态性C-1237等位基因(rs5743836)可能和哮喘有关,然而在更大人群的研究中测试更多的TLR9多态性时并未得到类似的发现。Lachheb等在突尼斯儿童的调查中认为哮喘的遗传过敏体质与TLR9和CD14的SNP有关,而对日本人的研究却未发现这一关系。

鉴于TLR9对变态反应性炎症主要起负性调节作用,目前提出TLR9可以作为过敏性疾病免疫治疗的新靶点。小鼠用CpG免疫后,其气道的免疫应答更倾向于Thl型,甚至可以使Th2优势的气道免疫发生逆转。另有报道CpG结合短豚草乳剂改善哮喘症状的效果明显强于单用CpG。TLR9配体在过敏性疾病中的治疗有两种不同的模式:免疫调节和疫苗。其免疫调节的机制主要是:TLR9配体激活巨噬细胞、DC、NK细胞、B细胞等,诱导合成IFN-γ和IL-6、IL-10、IL-12、IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase),抑制IgE的合成,IFN-γ增强支气管上皮细胞IDO的表达和酶学活性,IDO通过诱导Th2细胞的凋亡并抑制Th2细胞因子—而不是诱导Th1或者Treg反应—暂时地抑制Th2反应;而疫苗则是提供长期的治疗。TLR9配体的免疫调节是非抗原依赖性的,其配体可以抑制哮喘的早期和晚期反应,如减少BALF中的嗜酸性粒细胞、降低气道高反应性。TLR9配体还可以抑制过敏性鼻炎的早期和晚期反应,其处理的小鼠鼻腔内组胺、白三烯的释放减少,嗜酸性粒细胞浸润也减轻。目前已有数种TLR9的激动剂在小鼠及猴的实验中提示对哮喘有治疗作用,有些已经进入临床试验,并表现出一定的的治疗效果。

2.4其他TLR

现有国内外文献显示,TLR3、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR10等与过敏性疾病的发生发展也存在一定的关系。

TLR3主要负责介导双链病毒RNA的反应,主要通过MyD88非依赖性途径转导信号。体外研究显示,TLR3配体作用于气管平滑肌细胞可以增加其对缓激肽的反应性,提示TLR3介导的信号转导可能会促进气道高反应性。Nicholson等的研究表明数种呼吸道双链RNA病毒与TLR3相互作用,可以诱发成人哮喘加重。过敏性鼻炎患者鼻粘膜表达TLR2、3、4 mRNA和蛋白质表达上调,有症状者高于无症状者;在变应原激发后这三种受体的蛋白表达均增加;在花粉季节,TLR3 mRNA表达显著增加,TLR4 mRNA也略有增加,而TLR2 mRNA季节性变化不明显。TLR3转导的信号被认为可能会诱发或者加重过敏性疾病,阻断TLR3可能是预防或治疗过敏性疾病的一个有效方法。

TLR5主要表达于巨噬细胞、DC、Treg上,体外实验证实TLR5能识别沙门氏菌等细菌的鞭毛蛋白,其配体刺激CD4+CD25+Treg后并不促进其增殖,但能促进其表面Foxp3的表达[51],增强其抑制功能。TLR5、7、8可以通过MyD88途径诱导抗原递呈细胞合成IL-12或者IFN-a、β,提示可能在Th1分化中起到一定的作用。

目前已知的TLR7配体是s28463,又称为R-848,属于咪唑喹啉类药物。在过敏原激发之前,腹腔或者鼻内给予R-848可以抑制气道高反应性的发展以及Th2细胞因子的产生,降低血IgE水平。这种抑制主要包括两种机制:一是IFN-a介导的,通过直接抑制Th2反应提供即刻保护;另一种由CD8+T细胞介导,通过IFN依赖的模式抑制Th2反应诱导长期保护,由此提示TLR7配体对于抑制过敏性哮喘具有重要作用,而咪唑喹啉对哮喘的治疗具有潜在的价值。Moller-Larsen等对TLR7和TLR8的SNP分析得出,其与哮喘、鼻炎和IgE特异性增高相关,其中rs2407992(TLR8)和rs179008(TLR7)与哮喘的相关性最为显著。

TLR1、TLR6和TLR10定位在染色体4p14上,编码具有高度同源性的氨基酸序列。有研究观察到TLR6上的rs2381289 SNP的T等位基因和过敏性鼻炎有明确的联系,而TLR10上的rs11466651 SNP的A等位基因和过敏性鼻炎无联系。Hoffjan等研究了德国人群中TLR6基因中+744c/T(ser249-Pro)多态性位点与哮喘的相关性,结果发现T等位基因对于哮喘的发病具有一定的保护作用。TantiSira等也对此进行了研究,在56例非洲裔美国人哮喘患者和97位健康对照的研究中发现:T等位基因可以降低哮喘发病的危险性。目前还没发现TLR10的特异性配体,但在517例哮喘患者和519位正常人中发现TLR10-1031 G→A和TLR10-2322A→G多态性与哮喘发病有关,这一现象在独立的哮喘家系中得以重现。

3 结语

TLRs的发现和功能的鉴定使人类对天然免疫的认识达到一个新水平,也为感染性疾病、炎症性或自身免疫病的治疗提供了新的思路。TLRs已成为过敏性疾病研究的一个热点,抗原被相应的TLRs识别,启动细胞内信号转导通路,诱导炎性反应或抗炎基因及其一系列细胞因子的表达等。目前已对TLRs在鼻炎和哮喘等过敏性疾病中的调节作用进行了广泛的研究。初步资料显示,TLR2、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9对过敏性炎症主要起负性调节控制,通过诱导Treg细胞扩增等机制,促使免疫系统向Th1分化,抑制或逆转Th2反应,而不同种类和浓度的配体也可能产生不同的甚至是相反的效应。而TLR4是屋尘螨的主要模式识别受体,主要促进T细胞向Th2分化,促进过敏性疾病的发生。对TLRs的基因多态性也进行了初步的研究,发现某些SNP对过敏性疾病具有保护作用,有的具有促进作用。作为过敏原的主要识别受体,TLRs在哮喘和过敏性鼻炎中的表达水平和类型、触发的下游信号通路有何不同,进一步回答这些问题,对于阐明哮喘的发病机制具有重要的意义。从这一个意义上讲,TLRs可能是一个关键性靶点。

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